Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект посвящен дизайну и синтезу нетоксичных положительных контрастных агентов на основе комплексов гадолиния. Реализация поставленной цели достигается путем «настройки» ряда структурных и морфологических факторов на молекулярном и коллоидном уровнях. В частности, на молекулярном уровне выбрана концепция «больших» лигандов для комплексов гадолиния, на коллоидном – концепция «ультра-малых» коллоидных частиц. Поэтому в качестве объектов исследования на первом году реализации проекта получены гидрофильные коллоиды на основе комплексов гадолиния с органическими и неорганическими лигандами. Выбор органических лигандов определялся следующими факторами: (1) прочным связыванием гадолиния за счет бис-хелатирования, при котором остается достаточно много (не менее четырех) молекул воды в первой координационной сфере иона гадолиния; (2) относительно большой общий размер лигандов для того чтобы уменьшить количество молекулярных блоков, составляющих наночастицы. Для увеличения объема молекулярных блоков алкил-малонатные фрагменты были введены в качестве заместителей четырех фенольных групп тиакаликсарена в конформации 1,3-альтернат. Для «структурной настройки» длина алкил-малонатного фрагмента варьировалась в ряду пропил-бутил-пентил. Ионы гадолиния образуют со всеми производными комплексы с мольным соотношением металл:лиганд 1:1. Однако растворимость в воде полученных комплексов возрастает в том же ряду (пропил-бутил-пентил). Поэтому оптимальные коллоидные характеристики получены для комплексов с пропил-малонатными производными. В качестве гидрофильной оболочки коллоидов использованы полиэлекстролиты. Полученный результат показал неплохую релаксивность гидрофильных коллоидов при их коллоидной стабилизации монослоем полистиролсульфоната (r1 = 23.8 mM-1s-1 и r2 = 29.4 mM-1s-1, соответственно). Эти величины в 5-6 раз превышают аналогичные значения для коммерческих контрастных агентов, но уступают лучшим литературным данным (выше 50 mM-1s-1). Следует также отметить, что наличие четырех пропил-малонатных фрагментов на тиакиликсареновой платформе позволяет связывать только один ион гадолиния за счет бис-хелатной координации двух малонатных групп. Оставшиеся два по стерическим причинам не могут эффективно координировать ионы гадолиния, но их депротонизация в щелочных условиях приводит к растворению коллоидных наночастиц. Поэтому на втором году реализации проекта предполагается перейти в бис-алкил-малонатным производным, в которых две оставшиеся фенольные группы замешены алкильными группами. Эффективность внутрисферной гидратации ионов гадолиния в составе наноразмерных коллоидных частиц является еще одним структурным фактором, определяющим магнитную релаксивность гидрофильных коллоидов. Его оценка проведена для специфических лигандов на основе производных дикетонатов, являющихся эффективными донорами энергии для люминесценции тербия и европия. Это позволило получить коллоиды с различным (4 и 1 соответственно) количеством молекул воды в первой сфере гадолиния и сопоставить соответствующие релаксивности. Полученный результат согласуется с линейной зависимостью магнитной релаксивности от гидратного числа n в водных растворах парамагнитных наночастиц на основе комплексов гадолиния. Однако, данную тенденцию стоит проверить на большем количестве примеров. Результаты, полученные на первом этапе выполнения проекта, выявили бесперспективность дальнейшего использования полидиацетиленовых наночастиц (PDA, около 100 нм) в качестве гигантских органических лигандов для ионов гадолиния. Наличие множества карбоксильных групп на поверхности PDA наночастиц приводит к связыванию ионов гадолиния, что экспериментально подтверждается данными спектрофотометрии (по изменению спектральных характеристик наночастиц при депротонировании карбоксильных групп). Магнитно-релаксационные характеристики ионов гадолиния, связанных карбоксилатами на поверхности наночастиц, не превышают таковые для моноядерных карбоксилатных комплексов (r1 и r2 не превышают 8 mM-1s-1), что свидетельствует о том, что такой тип координации ионов гадолиния не затрудняет их внутреннего вращения. Авторами также проведен синтез PDA наночастиц с включенными в их состав молекулами тетра-дикетонов каликсаренов с фенольными группами замещенными на длинные (С9) алкильные фрагменты (для связывания с гидрофобным слоем PDA наночастиц). Однако, r1(2) характеристики ионов гадолиния, связанных модифицированными полидиацетиленовыми наночастицами уменьшились по сравнению с «чистыми» PDA наночастицами. Таким образом, необходимый для высоких значений релаксивности так называемый «режим медленного вращения» ионов гадолиния в составе наночастиц реализуется только при плотной упаковке комплексов гадолиния в кристаллические или аморфные наночастицы. В то же время, для получения таких наночастиц необходимо остановить процесс выпадения осадка нерастворимых комплексов на уровне наночастиц ультра-малого размера (не более 6 нм). Выбор гигантских (почти 3 нм в диаметре) сферических полианионов на основе полиоксометалатов, так называемых кеплератов (Kp), также укладывается в концепцию «больших» лигандов. Однако, полученные результаты выявили огромную разницу между кеплератами и PDA наночастицами в качестве лигандов для ионов гадолиния. Аммониевые соли кеплератов прекрасно растворимы в воде, заряд полианионов «-42» является предпосылкой их взаимодействия с катионами. При смешивании водного раствора кеплератов с избытком ионов гадолиния состав выпадающего осадка соответствует стехиометрии 13:1 (Gd:Kp). В сильно разбавленных растворах и при меньших чем 13:1 концентрационных соотношениях Gd:Kp удается получить наноразмерные коллоиды. Однако они нестабильны за счет процессов как окислительной деструкции кеплератов, так и агрегации коллоидных частиц с образованием осадков (устойчивы в течение нескольких часов). Включение наночастиц соответствующих комплексов в мицеллярные агрегаты триблок сополимеров позволяет существенно (устойчивы в течении недели как минимум) повысить устойчивость коллоидов. При этом, важно отметить, что достигнутые значения релаксивности (r1=96.4 mM-1s-1 и r2=115.3 mM-1s-1 при 0.47 Тл) являются рекордными, и могут быть увеличены до 150 mM-1s-1 (как минимум) за счет понижения мольного соотношения Gd:Kp. Таким образом, у кеплератов есть связывающие сайты, обеспечивающие максимальную и минимальную релаксивность. Этот структурный фактор еще предстоит детализировать. Более того, при увеличении напряженности магнитного поля до 1.5 Тл значения r1 уменьшаются не более чем на 15%, в то время как для наночастиц на основе комплексов гадолиния с производными каликсаренов рост напряженности поля от 0.47 до 1.41 Тл приводит к понижению r1 почти в два раза. Принимая во внимание, что напряженность 1.5 Тл – это наиболее широко используемая величина для медицинских томографов, конечно возникает вопрос как минимизировать это понижение. Причиной данной тенденции является магнетизация наночастиц в магнитном поле, поскольку при этом происходит одновременное с понижением r1 увеличение r2. Противостоять магнетизации может жесткость кристаллической упаковки. В самом деле, данные порошковой диффрактометрии свидетельствуют об аморфной природе наночастиц на основе комплексов каликсаренов, в то время как для наночастиц на основе кеплератных комплексов есть значительная доля кристалличности. Фактор жесткости супрамолекулярной упаковки в магнитной релаксивности также предстоит выяснить. В рамках первого этапа была изучена цитотоксичность синтезированных коллоидов по отношению к образцам стандартных клеточных линий в области концентраций, в которых их контрастирующий эффект практически значим.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На втором этапе выполнения проекта выявлена роль заряда и размера неорганических лигандов в процессах комплексообразования с ионами гадолиния и ассоциации комплексов в наночастицы. На примере анионных гексарениевых кластеров показано, что комплексообразование «маленьких» дианионов с ионами гадолиния вследствие нейтрализации их заряда сопровождается ассоциацией образующихся комплексов в наночастицы. Последние образуют устойчивые водные дисперсии при использовании триблок сополимеров в качестве гидрофильной оболочки наночастиц. Магнитно-релаксационные характеристики водных дисперсий наночастиц обусловлены двумя противоположно действующими факторами: (1) уменьшением гидратного числа ионов гадолиния вследствие вытеснения молекул воды донорными группами лиганда; (2) замедлением вращательного и поступательного движения ионов гадолиния за счет ассоциации комплексов в наночастицы. Первый фактор приводит к уменьшению, а второй – к увеличению релаксивности. В результате значения магнитных релаксивностей находятся в пределах 15-20 мМ-1с-1, что очень близко к величинам релаксивности для водных дисперсий наночастиц на основе комплексов гадолиния с производными каликсаренов и тиакаликсаренов. Движущей силой формирования наночастиц из комплексов гадолиния с неорганическими и органическими лигандами вследствие их различной растворимости в воде являются нейтрализация заряда и смена растворителя соответственно. Это определяет различие синтетических подходов для формирования наночастиц комплексов с органическими и неорганических лигандами. В частности, для водорастворимых неорганических лигандов формирование наночастиц происходит в результате простого смешения ионов гадолиния и лигандов в определенных условиях (концентрации, перемешивание, гидрофильный стабилизатор). Однако, на примере гексарениевых халькогенидных кластеров показано, что размер наночастиц зависит от природы халькогена в составе кластерного ядра, не участвующего в координации ионов гадолиния, поскольку в координации задействованы только апикальные цианиды. В частности, слишком большие для высокой релаксивности кристаллиты образуются для теллуридных кластеров, что согласуется с высокой степенью кристалличности, выявленной по данным порошковой диффрактометрии. Приемлемые (в несколько раз выше чем для коммерческих контрастных агентов) значения релаксивности, одинаковые для серного и селенидного кластеров получены при силе магнитного поля 0.47 Тл, что согласуется с их оптимальными для высокой релаксивности размерами (не более 10 нм). Однако, при увеличении силы поля до 1.5 Тл релаксивности наночастиц на основе селенидных кластеров существенно уменьшаются в отличие от аналогичных значений для серных кластеров. Наблюдаемые небольшие различия в порошковых диффрактограммах высушенных коллоидов на основе селенидных и серных кластеров позволяют предположить более жесткую упаковку соответствующих комплексов гадолиния с серными кластерами по сравнению с селенидными. Полученный результат впервые указывает жесткость/мягкость упаковки комплексов в составе наночастиц как фактора, влияющего на релаксивность коллоидов в магнитных полях выше 1.5 Тл. В рамках данного этапа выявлена корреляция между структурой органических лигандов на основе тиакаликс[4]арена в конформации 1,3-альтернат и релаксивностью наночастиц на основе их комплексов с ионами гадолиния. Полученные результаты позволяют добиться только приемлемых значений релаксивности (менее 20 мМ-1с-1) на основе лигандов данного типа, но выявляют существенное (почти в 5 раз) уменьшение релаксивности для комплексов с лигандами определенной структуры. Варьирование структуры имело целью сохранить центр связывания ионов гадолиния, при этом, увеличивая гидрофобность различных заместителей. Наличие гидрофобных заместителей на противоположном от связывающего центра ободе циклофановой молекулы не оказало существенного влияния на магнитно-релаксационные характеристики наночастиц. При этом, выявлена роль гидрофобных заместителей в непосредственной близости от центров связывания ионов металла: вероятно, гидрофобные трет-бутильные фрагменты замедляют обмен внутрисферных молекул воды с массой раствора. Одной из задач данного этапа было выявить основные факторы, обуславливающие рекордно высокую релаксивность коллоидов на основе комплексов гадолиния с кеплератами. Анализ скоростей релаксации при различных соотношения гадолиний:кеплерат выявил рекордно высокие значения релаксивности превышающие 150 мМ-1с-1 в результате координации акваионов гадолиния внешними порами Mo9O9 кеплератов. Очевидно, что такие высокие значения обусловлены существенным замедлением поступательного и вращательного движения ионов гадолиния вследствие их координации анионами гигантских (около 3 нм) размеров. При этом, внешний тип координации, очевидно, является фактором, способствующим гидратации ионов гадолиния. Однако, химическая нестабильность кеплератных сфер препятствует использованию таких комплексов в качестве контрастных агентов в томографии. В то же время, ассоциация комплексов кеплератов в наночастицы является эффективным способом замедлить процесс деградации. Как и для комплексов с «маленькими» кластерами движущей силой формирования наночастиц на основе комплексов с кеплератами является нейтрализация заряда кеплератного полианиона за счет связывания с большим количеством ионов гадолиния. Нейтрализация заряда и последующее формирование коллоидных наночастиц сопровождается понижением релаксивности за счет реализации наряду с внешним другого (внутреннего) типа координации ионов гадолиния, который сопровождается их дегидратацией. Поэтому концентрационные условия были оптимизированы для того, чтобы значения релаксивности были на уровне r1=96.4 и r2=115.3 мМ-1c-1 при силе поля 0.47 Тл при существенном замедлении процессов деградации, что позволяет сохранять все физико-химические, включая магнитно-релаксационные, свойства коллоидов практически без изменений в течение недели. Особое внимание на данном этапе выполнения проекта уделялось влиянию буферных растворов бычьего сывороточного альбумина (БСА) на коллоидные и магнитно-релаксационные характеристики разработанных наночастиц, а также их цитотоксичности. Наночастицы из комплексов гадолиния с «маленькими» органическими лигандами (производные тиакаликс[4]арена) и неорганическими на основе гексарениевых халькогенидных кластеров даже в высоких концентрациях не оказывают заметного угнетающего влияния на жизнедеятельность раковых и нормальных клеток. Более того, их магнитно-релаксационные параметры остаются на прежнем уровне в буферных растворах БСА. Эти факты являются предпосылкой высокой устойчивости данных наночастиц в биологических средах. Для наночастиц на основе кеплератов, устойчивость в буферных растворах БСА остается проблемой, поскольку наблюдается 20-25% понижение релаксивности данных наночастиц при переходе от водных к буферным растворам БСА. Более того, их влияние на жизнедеятельность клеток незначительно только в ограниченном концентрационном интервале, хотя безопасный концентрационный интервал обеспечивает эффективное контрастирование за счет высоких значений релаксивности комплексов гадолиния с кеплератами. Таким образом, полученные на втором этапе выполнения проекта результаты подтвердили перспективность использования полианиононных полиядерных комплексов, а именно гексарениевых халькогенидных кластеров и полиоксометалатов (кеплератов) в качестве лигандов для формирования наночастиц с функцией контрастных агентов для ЯМР томографии за счет эффективного комплексообразования с ионами гадолиния и само-агрегации образующихся комплексов в наночастицы. Выявлены основные факторы (размер и заряд неорганического лиганда, тип связывания ионов гадолиния) влияющие на магнитно-релаксационные свойства комплексов гадолиния и/или наночастиц на их основе.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На этапе 2019 года выявлено соотношение структурного и коллоидного факторов в комплексообразовании ионов Gd(III) с полианионами гексарениевых кластеров и кеплератов и формировании на их основе Gd(III)-содержащих наночастиц, функционирующих как контрастные агенты. (1) Например, на примере комплексообразования высокозарядного кластера [{Re6Q8}(SO3)6]10- с ионами Gd(III) показано, что даже в разбавленных растворах кластера координация ионов Gd(III) в соотношении 1:1 приводит к агрегации образующихся комплексов, сопровождающееся заметным повышением величин r1(2), которые составляют r1(2) = 21.0(24.1) и r1(2) = 25.9(29.8) mM–1s–1 для сульфидных (Q = S) и селенидных (Q = Se) кластеров. Очевидно, что движущими силами этой агрегации являются как мостиковая координация ионов Gd(III) между циано-группами соседних кластерных блоков, так и взаимодействие с противоионами (ионами натрия). Более того, при высоких концентрациях кластера (0.3 мМ) агрегация и повышение магнитной релаксивности выше 20 mM–1s–1 наблюдаются при недостатке ионов Gd(III), то есть при соотношениях Gd:кластер ниже эквимолярных. Впервые выявлены условия формирования водорастворимых агрегатов, предшествующих образованию коллоидных наночастиц. При этом, величины магнитной релаксивности твердых наночастиц и водорастворимых агрегатов одинаковы. (2) Размер кеплерата около 3 нм в диаметре является предпосылкой заметного замедления поступательного и вращательного движения акваионов гадолиния при их координации внешними порами Mo9O9 и W3Mo6O9 кеплератов Mo132 и W72Mo60, в то время как кеплераты близкого размера Mo72Fe30/V30 менее эффективно связывают [Gd(H2O8]3+ за счет изменения размера внешних пор (Mo3Fe3O6 и Mo3V3O6). Однако, молекулярные комплексы кеплератов Mo132 и W72Mo60 с ионами Gd(III) существуют только при мольных соотношениях Gd(III):кеплерат 1:1, уже при соотношении Gd:кеплерат 3:1 наблюдается заметная агрегация кеплератных сфер, фиксируемая методами динамического светорассеяния и малоуглового рентгеновского рассеяния. Агрегация Gd(III)-связанных кеплератов сопровождается понижением величин r1(2). Более того, наблюдается корреляция между размерами агрегатов и их магнитно-релаксационными характеристиками. Данные ядерной магнитной релаксации при варьировании напряженности поля подтвердили, что ионы гадолиния связываются кеплератами Mo132 без дегидратации, то есть в виде [Gd(H2O)8]3+ за счет взаимодействия с атомами кислорода пор {Mo9O9}. Однако, это связывание не исключает равновесия между связанными и свободными ионами гадолиния, поскольку противоионы (ионы аммония) эффективно конкурируют за связывание с порами {Mo9O9}. Эта конкуренция становится особенно заметной при сопоставлении комплексообразования ионов Gd(III) с кеплератами Mo132 с зарядами «-72» и «-42» за счет наличия в полости кеплерата 30 ацетатных и гидрофосфатных анионов соответственно. Таким образом, есть две причины понижения величин r1, r2 при увеличении мольного соотношения Gd:кеплерат от 1:1 до 10:1: (1) накопление «свободных» акваионов гадолиния с низкими (14 и 16 мМ-1с-1) величинами r1, r2; (2) агрегация комплексов гадолиния с кеплератами, затрудняющая обмен молекул воды между первой координационной сферой и массой раствора. (3) Отрицательный заряд кеплератов, также обусловленный их структурой, является важнейшей движущей силой связывания [Gd(H2O8]3+ кеплератными сферами. Роль заряда обуславливает различие в связывании акваионов гадолиния незаряженным кеплератом Mo72Fe30 и заряженным Mo72V30. Однако, с увеличением отрицательного заряда от «-42» для кеплератов Mo132, полость которых заполнена ацетатными анионами к кеплерату с зарядом «-72» за счет заполнения полости дианионами гидрофосфата эффективность связывания [Gd(H2O)8]3+ уменьшается за счет конкурентного связывания противоионов. Данная тенденция была выявлена на основе концентрационных зависимостей магнитно-релаксационных данных и подтверждена результатами магнитно-релаксационных измерений при разных напряженностях магнитного поля (частотах) на ядрах 1H. Соответствующие частотные зависимости магнитно-релаксационных данных показывают, что продольная релаксивность ионов гадолиния в составе комплексов сохраняется на высоком уровне в полях различной частоты, включая частоты применяемые в медицинских магнитно-резонансных сканерах. Данный факт позволит использовать малые дозы гадолиния в составе кеплератных нанокапсул и снизит риск выхода токсичных ионов Gd(III). (4) На этапе 2019 года была решена проблема стабилизации Gd(III)-связанных кеплератов для уменьшения выхода токсичных ионов Gd(III) и образования токсичных молибдатов в результате окислительной деградации кеплератов. Полученные результаты позволили оценить перспективы так называемого «коллоидного» подхода к стабилизации комплексов кеплератов с ионами гадолиния. В рамках этого подхода стабилизация обусловлена двумя процессами: агрегацией комплексов в наночастицы и формированием их гидрофильной оболочки. Однако, полученные в ходе реализации проекта результаты обнаружили, что более результативным подходом к увеличению стабильности гадолиний-связанных кеплератов является переход от наночастиц к молекулярным комплексам при условии использования кеплерата определенной структуры, а именно W72Mo60. Структура кеплератов имеет огромное влияние на их устойчивость к окислительной деградации, играющей ключевую роль в цитотоксичности комплексов кеплератов. Оптимальным выбором с точки зрения химической устойчивости, низкой цитотоксичности и высокой магнитной релаксивности является кеплерат W72Mo60, образующий устойчивые комплексы с [Gd(H2O)8]3+, которые сохраняют высокую релаксивность в буферных растворах белков, в то время как ионный обмен и дополнительная агрегация в буферных растворах белков являются факторами, понижающими магнитную релаксивность комплексов кеплератов в составе наночастиц. Поэтому оптимальным способом решения перечисленных проблем является использование структурного фактора для стабилизации кеплератов и образования комплексов гадолиния с кеплератами в соотношении 1:1 для минимизации ионного обмена в буферных растворах. Молекулярные комплексы W72Mo60 с ионами гадолиния состава 1:1 не нуждаются в дополнительной стабилизации, но их включение в мицеллярные агрегаты триблок сополимеров является предпосылкой нейтрализации их отрицательного заряда за счет противоионов, поскольку катионы концентрируются в гидрофильном слое мицеллярных агрегатов за счет эффективного связывания полиэтиленоксидными цепями триблок сополимеров. Следовательно, по параметрам гидрофильности, заряда и стабильности в качестве основы для контрастных агентов предложено использовать комплексы W72Mo60 с ионами гадолиния состава 1:1, включенные в мицеллярные агрегаты триблок сополимеров.